2017-11-15 黄保/秦安
机体衰老与衰老的细胞增加相关,最终能驱使多种并发症的发生。DNA损伤的积累或其他细胞应激(致癌物、有害代谢产物等)不仅会导致细胞增生,也会加速染色质固缩和分泌蛋白改变的这一衰老过程。衰老的细胞不仅高表达生物标志物p16Ink4a (Cdkn2a,细胞周期相关的激酶抑制剂和肿瘤抑制因子,减弱G1到S进程),而且抵抗凋亡。此外,衰老的细胞具有衰老相关的外泌表现(senescence-associated secretory phenotype, SASP(IL-6,IL-8,PAI-1(内皮细胞纤溶酶原激活物抑制剂)等)),包括促炎因子、趋化因子、降解细胞外基质蛋白质,这会影响局部和全身的功能。甚至,相对较少的衰老细胞量(∽10-15%)足以导致组织功能障碍。前期已证实,在老年时机体骨微环境内多种细胞都会衰老,而衰老的骨髓细胞和骨细胞会明显地产生SASP。总结就是:衰老的细胞不仅抵抗凋亡,还产生有害物质影响机体功能。作者从衰老的角度进一步对年龄相关的骨松进行研究。
分三部分进行:
1)转基因:INK-ATTAC transgene
2)抗衰老药物 :senolytic包括D:达沙替尼(抗癌)+:Q槲皮素(抗组胺和消炎药)
3)抑制衰老相关外泌促炎因子产生:卢索替尼(JAKi)
第一部分:转基因。
首先再次明确衰老的小鼠骨细胞高表达p16Ink4a
Supplementary Fig. 1:a)雌性C57和b)雄性C57随着时间变化p16Ink4a的表达,18月龄之后明显升高。c-f)6月龄与20月龄雌性C57的骨量统计:腰椎BMD、总的BMD、骨小梁BMD、皮质骨BMD。g-j)6月龄与20月龄雄性C57的骨量统计:腰椎BMD、总的BMD、骨小梁BMD、皮质骨BMD
构建胚胎转基因INK-ATTAC小鼠。
p16Ink4a(细胞相关的激酶抑制剂和肿瘤抑制因子)启动子
十六烷基化FKBP-Cas8
IRES:核糖体内部进入位点
EGFP增强型荧光蛋白便于检测
AP20187可作为二聚化(CID)的化学诱导剂
衰老细胞表达p16Ink4a,启动FKBP-Casp8表达,在AP20187的二聚化作用下形成有活性的Casp8,从而促进该细胞的凋亡。So年轻小鼠或正常细胞也表达p16Ink4a,不也会走向凋亡么?
Fig1 清除p16Ink4a阳性细胞可防止老年性骨松
Fig1 a)实验设计: 20月龄雌性INK-ATTAC老鼠,腹腔注射AP20187(每周两次,共4月,10mg/kg)
Fig1 b-c)用药组与对照组相比p16Ink4a和EGFP表达明显下降
Supplementary Fig. 3铯辐照(IR,10 Gy,20天)诱导衰老相关标志物产生a) 衰老基因p16Ink4a高表达 b-c)衰老细胞形态扁平、核更大(senescence-associated distention of satellites,SADS,是染色质的非折叠形式,区别于转录时的解凝状态) (辐照93% versus 对照13%) d) 衰老相关的β半乳糖苷酶(β-Gal)活性检测(辐照77%versus对照21%)
β-Gal广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中,能够催化β半乳糖苷化合物中β半乳糖苷键水解,此外还具有转半乳糖苷的作用。β-GAL不仅可为植物的快速生长释放储存的能量,还能在正常的多糖代谢、细胞壁组分代谢以及衰老时细胞壁降解过程中催化多糖、糖蛋白以及半乳糖脂末端半乳糖残基的水解,释放自由的半乳糖。
测定原理:β-GAL 分解对-硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷生成对-硝基苯酚,后者在400nm 有最大吸收峰,通过测定吸光值升高速率来计算β-GAL 活性
Fig1 d-e)用药组与对照组皮质骨骨干内衰老骨细胞与非衰老骨细胞的SADS结果 f)量化
Fig1 g-h)用药组与对照组性腺旁脂肪组织p16Ink4a和EGFP的表达差异进一步验证
Fig1 i-n)用药组与对照组腰椎体小梁骨的microCT图像、骨体积分数、骨小梁数量、厚度、间距和结构模型指数(数值越低越好)
Supplementary Fig. 4a–f)股骨骨小梁与腰椎骨小梁结果一致。
用药组与对照组股骨小梁骨的microCT图像a、骨体积分数b、骨小梁数量c、厚度d、间距和结构模型指数(数值越低越好)e。
Fig1 o-u) 用药组与对照组股骨microCT图像o,皮质骨厚度p,骨强度q(有限元分析),股骨内皮质破骨细胞数量r、成骨细胞数量s、矿化速率t、骨形成速率u。 表明骨吸收减少和骨形成增加
Supplementary Figure 5 AP20187治疗组有更好的生物力学特性和骨质。
第6尾椎生物力学分析a-e(压力测试)和第7尾椎骨质分析f-g(纳米压痕):椎体高度a、屈服载荷b、极限载荷c、水平位移d、能量e,第7尾椎的刚度f、硬度g。
b屈服载荷(最小载荷):材料发生变化所需要的力
c极限载荷(最大载荷):材料发生断裂所需要的力
d位移: 在水平方向上做压力,让材料发生变化所产生的位移
e 能量:相当于是力乘以位移产生的能量。
f 刚度: 材料或结构在受力时抵抗弹性变形的能力
g硬度:材料局部抵抗硬物压入其表面的能力
Supplementary Figure6 然而用AP20187治疗12月龄雌性INK-ATTAC小鼠不影响骨量。a)实验设计,b-g)腰椎microCT图像b,骨体积分数c、骨小梁数量d、厚度e、间距f和结构模型指数g,h-o) microCT图像h,骨体积分数i、骨小梁数量j、厚度k、间距l、结构模型指数m和股骨皮质骨的厚度n、压力负荷o。
Supplementary Figure 7腰椎破骨细胞数量明显下降,但是成骨活性并没有明显改变 a-d)破骨细胞数量a、成骨细胞数量b、矿化速率c、骨形成速率d。
那么AP20187是不是影响了Oc的凋亡而导致Oc数量减少呢?衰老的细胞到底会不会影响成骨活性呢?
于是Supplementary Figure 8 发现AP20187抑制体内Oc形成,但对成熟的Oc没有直接影响. a)用AP20187的衰老组血清骨吸收指标CTX明显下降,而年轻组内没有明显差异,b)分化成熟的Oc并不受AP20187的影响,c)量化,d)caspase3/7活性发现AP20187也不诱导成熟的破骨细胞凋亡,e-g)与年轻组相比,衰老组、衰老+AP20187治疗组成骨活性均减低e,骨吸收也减少,但治疗组破骨活性更低f,所以治疗组骨形成有所升高g,但仍低于年轻组
那么衰老的细胞会不会直接影响成骨呢?
Fig1 v-w)MC3T3 CM 21天茜素红染色v、量化w。表明:衰老细胞CM抑制成骨,清除衰老细胞改善成骨。
更深层次的机制是什么呢?
Supplementary Figure 9 原来清除衰老细胞后可以减少骨细胞Sost, RANKL, OPG 表达和抑制骨髓脂肪细胞数量、直径和体积。 a-d)Sost, RANKL, OPG, OPG/RANKL之比。E-g)骨髓脂肪细胞的数量、直径、体积
Fig1总结:用转基因的方法证实AP20187清除衰老骨细胞,从而抑制骨吸收和促进成骨,促进机体形成生物力学特性和骨质均更好的骨。AP20187对成熟Oc没有影响,但可抑制体内Oc形成,机制不清。
因为基因治疗比较有限,所以用药物进一步证实
第二部分:抗衰老药物 :senolytic包括D达沙替尼(抗癌)和Q槲皮素(黄烷醇,抗组胺和消炎药)
Fig 2用药物senolytics(D + Q)清除衰老细胞可防止老年性骨松
a) 实验设计:用20月龄的C57,灌胃每月一次,总4月,D5 mg/kg and Q50 mg/kg
b) 用药组骨细胞p16Ink4a表达明显减少
c) 皮质骨干内衰老骨细胞(SADS)明显减少
d) 性腺旁脂肪组织p16Ink4a也表达明显减少
e-g) β半乳糖苷酶(β-gal)阳性脂肪细胞数明显减少
h-m) 改善的腰椎体的microCT图像h、骨体积分数i、骨小梁数量j、厚度k、间距l和结构模型指数(数值越低越好)m
Supplementary Figure 10 与腰椎结果一样,股骨骨小梁也有明显的改善:a-f)股骨microCT图像a、骨体积分数b、骨小梁数量c、厚度d、间距e和结构模型指数(数值越低越好)f 。 g-j)与之前一致,腰椎骨小梁破骨细胞数量g明显减少,但是成骨细胞数量、矿化速率、骨形成率没有明显差异。
n-t) 用药组与对照组股骨microCT图像n,皮质骨的厚度o,骨强度p(有限元分析),股骨内皮质破骨细胞数量q、成骨细胞数量r、矿化速率s、骨形成速率t。 表明D+Q可以产生厚的皮质骨和更好的骨强度。
Fig2 总结:药物(D + Q)方法与基因(INK-ATTAC)方法一样,均可清除衰老细胞,从而达到衰老个体骨小梁和皮质骨微体系结构几乎相同的改善程度,表明其可能有共同的细胞学机制。
到底是什么机制呢?
深入探索防止骨松的机制。
因为在体内清除衰老细胞与较少的Oc和骨吸收有关,所以接下来看衰老细胞对破骨细胞分化影响(用人肾旁脂肪干细胞AdMSC ,正常的 CM20%,衰老AdMSC(铯辐照,10 Gy,20天)的CM20%
第三部分:抑制衰老相关外泌促炎因子产生:卢索替尼(JAKi)
Fig 3 衰老细胞产生的SASP通过增加破骨细胞前体的数量来促进破骨细胞分化
用SEN-CM处理股骨骨髓提取的细胞发现:
a-b)SEN-CM促进破骨细胞分化(1:50 CMB 14-12 supernatant(source of M-CSF44) and 200 ng/mlRANKL a、量化b
c) SEN-CM促进破骨细胞标志基因Ctsk, Oc-stamp, Oscar, Tnfrs11a (Rank), and Acp5的表达
d-e)SEN-CM增加了CD115+RANK-破骨前提细胞的量(第二象限)
f) SEN-CM减少了整个骨髓提取细胞的凋亡
g)也减少了单核细胞的凋亡( 提取单核细胞Mouse Monocyte Isolation Kit+MACS)
h-i)JAKi(0.3μM)处理过的衰老细胞,提取的CM反而并不促进Oc分化
j)IL-6/IL-8/PAI1中和抗体可以抑制SEN-CM促进Oc分化的作用
Supplementary Figure 11 a)在同等细胞密度下,SEN-CM预处理单核细胞并没有影响Oc分化,表明SEN-CM对单核细胞分化成Oc没有直接影响。b)衰老细胞CM中加入JAKi并没有抑制Oc分化 说明JAKi的作用是通过抑制衰老细胞产生SASP来抑制破骨细胞分化,进一步用促炎因子的中和抗体进行验证Fig 3 j)
Supplementary Figure 13 a-b)JAKi治疗组提取的骨髓中粒细胞、巨噬细胞克隆数减少 c-d)Oc分化也受到抑制 e)JAKi治疗不影响年轻小鼠Oc分化
总结:Fig 3 SEN-CM可以抑制破骨细胞前体的凋亡,增家破骨细胞前体的数量,从而促进破骨细胞形成,但这种效果可以被JAKi抑制
在体外JAKi可以抑制衰老细胞产生SASP的相关促炎因子,体内效果如何呢?
Fig 4 在体内JAKi卢索替尼抑制SASP,防止老年性骨松
a) 实验设计:22月龄雄性C57,JAKi每天60mg/kg,2个月
b-g) 腰椎体骨小梁的microCT图像b、骨体积分数c、骨小梁数量d、厚度e、间距f和结构模型指数g(数值越低越好)
h-m) 与腰椎一致,股骨骨小梁的microCT图像h、骨体积分数i、骨小梁数量j、厚度k、间距i和结构模型指数m(数值越低越好)
n)最大载荷,治疗组骨强度更大
o)治疗组Oc数量更少
p)成骨细胞数量没有改变
q)抗破骨细胞吸收药物在抑制Oc的同时抑制了Ob
r)Senolytic通过清除衰老细胞,不仅抑制Oc,而且促进了Ob
Supplementary Figure 12 JAKi对年轻小鼠骨量没什么影响
a)实验设计:7月龄年轻雄性C57,JAKi每天60mg/kg,2个月
b-g) 腰椎体骨小梁的microCT图像b、骨体积分数c、骨小梁数量d、厚度e、间距f和结构模型指数g(数值越低越好)
h-n) 与腰椎一致,股骨骨小梁的microCT图像h、骨体积分数i、骨小梁数量j、厚度k、间距i、结构模型指数m(数值越低越好)、皮质骨厚度n
o)最大载荷
Supplementary Fig. 14. JAKi治疗a后IL-6, IL-8和PAI-1血清水平下降,而AP20187治疗b、D+Q治疗c 后IL-6, IL-8和PAI-1血清水平没有明显差异。
总结:本文用三种方法验证清除衰老细胞或者抑制衰老细胞产生的促炎因子可以减少骨丢失。这3种方法对衰老骨骼的影响非常相似。 它们都通过减少骨吸收(骨密度、强度下降)、维持或者增加骨形成(提高骨密度),实现骨骼质量和强度的改善。这一策略与目前所有治疗骨质疏松的药物有本质的不同。所以借助于抗衰老药物靶向清除这些衰老细胞,有望治疗老年性骨质疏松。
参考文献(公众号对话框回复“JC63”下载原文)
1 Farr JN, Xu M, Weivoda MM et al. Targeting cellular senescence prevents age-related bone loss in mice. Nat Med 2017; 23:1072-1079.
原文链接:
https://pan.baidu.com/s/1sl9xWCX#list/path=%2F%E6%96%87%E7%8C%AE%E5%AF%BC%E8%AF%BB%2F%E7%AC%AC%E5%85%AD%E5%8D%81%E4%B8%89%E6%9C%9F%E3%80%90%E7%A7%91%E7%A0%94%E5%B0%8F%E5%8A%A9%E6%89%8B%E5%BE%AE%E4%BF%A1%E5%8F%B7SciRes%E3%80%91